無菌產(chǎn)品是指產(chǎn)品上無存活微生物的產(chǎn)品。醫(yī)療器械滅菌的國家標(biāo)準(zhǔn)要求，當(dāng)需要提供無菌產(chǎn)品時(shí)，要用各種措施使醫(yī)療器械各種來源的外來污染減至最少。多年來人們對醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)、保存和使用過程中出現(xiàn)的微生物污染問題進(jìn)行了許多研究和評估。為控制產(chǎn)品中的微生物，要求無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)企業(yè)建立和實(shí)施有效的質(zhì)量管理體系，生產(chǎn)廠房按生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量要求分為一般生產(chǎn)區(qū)和潔凈區(qū)，對生產(chǎn)的過程進(jìn)行管理，盡量減少醫(yī)療器械產(chǎn)品的微生物污染。然而，在自然界，微生物無處不在， 即使是在標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)條件下按照醫(yī)療器械質(zhì)量體系進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)品上也可能帶有微生物。因此，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，對醫(yī)療器械產(chǎn)品上的微生物進(jìn)行檢驗(yàn)。
（一）微生物限度檢測引用標(biāo)準(zhǔn)
目前，對醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行微生物檢測常用的標(biāo)準(zhǔn)為：《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ J“ 微生物限度檢查法”；GB/T 19973.1-2005《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)》；
（二）醫(yī)療器械的微生物檢測方法
微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。
1.供試液制備要求 《中國藥典》（2010年版二部）附錄Ⅺ J“ 微生物限度檢查法”規(guī)定，微生物限度檢查應(yīng)該在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法包括平皿法和薄膜過濾法。細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30～35℃；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃。一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml，膜劑為100cm2,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1：10的供試液。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑不得少于4片。應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)性,采取適宜的方法備供試液。試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)過45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過1h。
GB/T 19973.1-2005《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)》指出:微生物在表面附著的程度受表面特性、微生物自身和存在的其他材料（如潤滑劑）的影響。污染源也會影響到附著程度。為獲取微生物，所進(jìn)行的處理包括漂洗（同時(shí)施加物理力）或直接表面取樣。表面活性劑可以用于提高回收，但應(yīng)認(rèn)識到，較高濃度的表面活性劑可能會抑制微生物。其中供試液制備的方法有：袋蠕動、超聲洗脫、攪動（帶或不帶玻璃珠）、渦旋式混合、沖洗、攪切（碎解）、擦拭、瓊脂覆蓋、接觸板等。
此外，GB15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》及GB15980-1995《一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》也給出了一定的要求。
GB15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，在100級凈化條件下用無菌方法打開用于檢測的至少3個包裝，從每個包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10g±1g樣品。剪碎后加入到200ml滅菌生理氯化鈉溶液（生理鹽水）中，充分混勻，得到一個生理氯化鈉溶液樣液，液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。
GB15980-1995《一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》針對初始污染菌檢測所規(guī)定的采樣方法是：對可破壞性方法取樣的醫(yī)療用品，如輸液（血）器，注射器、注射針、透析器及各類導(dǎo)管等，按《中國藥典》（2010年版）規(guī)定執(zhí)行；對不能用破壞性方法取樣的特殊醫(yī)療用品可用浸有生理氯化鈉溶液的棉拭子涂抺采樣，被采表面<100cm2取全部表面；被采表面≥100cm2取100cm2；敷料類可用無菌手續(xù)取10g，放入100ml滅菌生理氯化鈉溶液中，充分振蕩后取樣。采樣數(shù)量:各類產(chǎn)品每批隨機(jī)抽取10件樣品。
2.細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 《中國藥典》（2010年版二部）附錄Ⅺ J“ 微生物限度檢查法”規(guī)定：計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法包括平皿法和薄膜過濾法。按照計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)的程序進(jìn)行供試液制備。釋稀釋成1：10、1：102、1：103等稀釋級的供試液。
平皿法規(guī)定根據(jù)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級的供試液1ml，置直徑90m的無面平皿中,注入15～20ml溫度不超過45℃的融化的營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅納瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻,凝固，倒置培養(yǎng)，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板，一般營養(yǎng)瓊脂用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3d，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5d，逐日觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí),可適當(dāng)延長培時(shí)間到7d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。細(xì)菌、醇母菌宜選取平均落數(shù)小于300cfu，霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml、10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級的平板均無菌落生長?；騼H最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
薄膜過濾法是《中國藥典》(2000年版)附錄開始收載的無菌及微生物限度檢查的檢驗(yàn)方法之一。近年來，在檢驗(yàn)中應(yīng)用日趨廣泛，具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)?？蔀V過較大量的檢品和可濾除抑菌性物質(zhì)，濾過后的薄膜，可直接接種于培養(yǎng)基中，或直接用顯微鏡觀察，本法具有靈敏度高、不易產(chǎn)生假陰性結(jié)果、減少檢測次數(shù)、節(jié)省培養(yǎng)基及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。薄膜過濾法的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm，供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。沖洗后取出濾膜、菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅納瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備1張濾膜。培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。以1g、1ml、10cm2供試品中的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以<1報(bào)告菌數(shù)，或以<1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
GB/T 19973.1-2005《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)》提出修正系數(shù)的概念，它是指用于對活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行修正的數(shù)值，以補(bǔ)償產(chǎn)品上無法完全洗脫的微生物，以便計(jì)算出生物負(fù)載估計(jì)值。對生物負(fù)載估計(jì)進(jìn)行確認(rèn)應(yīng)包括下列步驟：1、對從產(chǎn)品上取下微生物所用技術(shù)的適當(dāng)性評價(jià)，如果取下微生物是該技術(shù)的一部分；2、對計(jì)算所取下微生物數(shù)量所用技術(shù)（包括微生物計(jì)數(shù)技術(shù)和培養(yǎng)條件）的適當(dāng)性的評價(jià)；3、確立所用方法的回收效率，以便計(jì)算出修正系數(shù)。
3.控制菌的檢測 《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ J“ 微生物限度檢查法”規(guī)定：
表1 藥典中控制菌檢查方法
| 項(xiàng) 目 | 《中華人民共和國藥典》2010年版 |
大腸埃希菌 | 膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌18～24h后，轉(zhuǎn)種到MUG培養(yǎng)基觀察是否呈現(xiàn)熒光，沿管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結(jié)果。如不能判斷，劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。 |
大腸菌群 | 乳糖膽鹽發(fā)酵管，若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。若疑似，再接種于乳糖發(fā)酵管。 |
沙門菌 | 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)18～24小時(shí)，轉(zhuǎn)種至四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h，分別劃線于膽鹽乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24h，若疑似，用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。 |
銅綠假單胞菌 | 膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌18～24h后，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)18～24h。若疑似，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)，綠膿菌素試驗(yàn)。 |
金黃色葡萄球菌 | 亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h，劃線于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24～72h，若疑似，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h，做血漿凝固酶試驗(yàn)。 |
梭菌 | 梭菌增菌培養(yǎng)基，厭氧條件培養(yǎng)48h ，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板，厭氧條件培養(yǎng)48～72h，若有菌生長，進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。 |
白色念珠菌 | 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72h，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24～48h，若疑似，接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24～48h。若有綠色或翠綠色菌生長，再接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h，染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)。 |
（三）儀器設(shè)備及器具
試驗(yàn)所需要的儀器設(shè)備及器具：超凈工作臺或生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、高壓蒸汽滅菌器、燒杯、試管及塞、培養(yǎng)皿、量筒、吸管等。